استنسال والتعبير الجيني خارج الخلية للبروتييز القاعدي المتحمل للحرارة من بكتريا Bacillus stearothermophilus AEAL2 في خميرة الخبز

        يمتلك الانزيم الخارج خلوي سيرين البروتييز القاعدي العديد من التطبيقات الصناعية وخاصة في صناعة المنظفات ، وقد يكون الاهم صناعيا . هدفت الدراسة الى تطويرعملية ايض السلالة خميرة الخبز (Pichia pastoris) هندسيا لانتاج انزيم سيرين البروتييز القاعدي والثابت حراريا من العزلة المحلية (Bacillus stearothermophilus AEAL2) باستخدام تقنيات الهندسة الوراثية . في الجزء الاول من الدراسة نميت البكتريا المحلية تحت الظروف المثلى (55 درجة مئوية لمدة 48 ساعة) في الوسط الانتاجي الملائم للانتاج الانزيم. إما الجزء الثاني من الدراسة فقد صمم لانتاج الانزيم الثابت حراريا في النظام التعبيري للـخميرة الخبز  (P. pastoris) والحصول على انتاج كمية عالية من الانزيم، إذ تم تضخيم جين البروتييز من العزلة البكتيرية (Bacillus stearothermophilus AEAL2) باستخدام تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل للدنا (PCR) وباستخدام بادئات متوافقة مع تتابعات جينات انزيم السيرين القاعدي للانواع ذات الصلة . وقد تم استنسال قطعة الدنا المضخمة المشفرة للبروتييز في ناقل الاستنسال (pPICZαA vector) (المحرض بالميثانول) وهو من النواقل مكوكية، واستخدمت الجزيئات الهجينة لتحول بكتريا (E.coli) لغرض الاكثارقبل عملية التحول في المضيف . بعدها تم ادخال الناقل الهجين في موقع (AOX1 locus) لجينوم السلالة (P. pastoris X-33). تم اختيار المتحولات الموجبة على الوسط الزرعي الصلبYPD agar))  والحاوي على 100 مايكروغرام لكل مليليتر من (zeocin) ، وسميت النسخ الحاملة لجين البروتييز القاعدي ضمن جيناتها بـ (PE1). وجد ان الوسط الغذائي (YTPM) هو الافضل لانتاج اعلى تعبير جيني. تم افراز البروتييز المتحول من نظام التعبير (P. pastoris) بنجاح في الوسط الغذائي بقيادة اشارة الافراز (factor -α) ومع هذا فان تعبير وافراز البروتييز حققت اعلى انتاجية إذ بلغ افرز البروتين الهجين للوسط الزرعي وبفعالية وصلت 7956.5 وحدة لكل مليغرام مقارنة مع 1152 وحدة لكل مليغرام انتجت من الكائن الطبيعي (Bacillus stearothermophilus AEAL2). تمت تنقية البروتين الهجين بخطوة واحدة باستعمال تقنية كروموتوغرافيا التداخل الكارهة للماء باستخدام هلام هيدروكسيابيتيت وكانت الحصيلة الانزيمية (Yield%)  17.58 وعدد مرات تنقية (Fold) 6.796 ، بينما نقي الانزيم من الكائن الاصلي بثلاث خطوات تنقية بلغت الحصيلة الانزيمية فيها 18.63 وعدد مرات تنقية 10.65 . هذه النتائج تظهر امكانية زيادة مستوى التعبيرلجين البروتييز(AEAL2 protease) في نظام خميرة الخبز وبدون اي تاثير على وظيفة الانزيم .