انتاج الاضداد ( IgY ) من صفار بيض الدواجن باستخدام انزيم الكلوكوسيل ترانسفيريز المنقى من العزلة المحلية Streptococcus mutans النمط C المعزولة من تكلسات الاسنان

موجزالاختراع :

      يتضمن مشروع الاختراع الحالي انتاج الاجسام المضادة في صفار بيض الطيور باعتباره مصدر رخيص ومتوفر يمكن ان يكون بديلا عن استخدام الطرائق التقليدية في انتاج اللقاحات من دم حيوانات اللبائن وبالتالي هذا سوف يعمل على رفع امكانية التعويل على الحماية ضد هذه البكتريا Streptococcus mutans serotype C  المسببة لتنخر الاسنان من خلال تحفيز انتاج الاجسام المضادة والمحضر من بيض الطيور الممنعة بمستضدات هذه البكتريا . 

وقد تم التوصل الى مايلي :

1- تعد بكتيريا   Streptococcus mutans  العامل المسبب لتنخر الاسنان ووجود مجموعة mutans streptococci بمستوى عالي في التكلسات (plaque ) له علاقة بالاصابات الخطرة لتنخر الاسنان. تم جمع 75 عينة كلس من اسنان اشخاص وبمختلف الاعمار ومن كلا الجنسين واعتبرت 42 عينة ايجابية بنموها على وسط Mitist Salivares Agar (MS) , ومن بين هذه العزلات اعتبرت35 عزلة تعود الى جنس Streptococci , فقط 29 عزلة تعود الى مجموعة mutans streptococci طبقا لقدرتها على انتاج نوع خاص من السكريات المتعددة, 12 عزلة فقط تعود بـ الى جنس Streptococcus mutans بنسبة 41 % اعتمادا على الطرق البايوكيميائية و التصبغ triphenyltetrazolium chloride وعلى التحمل بتركيز عالي من NaCl .

2- صنفت 6 عزلات من نوع Serotype C اعتمادا على Lancefied group) ) , اختبرت هذه العزلات لانتاج انزيم الكلوكوسيل ترانسفيريز بوساطة تحديد الفعالية النوعية, كانت العزلات كافة لها القدرة على انتاج الانزيم وشخصت العزلة رقم (H5) كافضل عزلة منتجة للانزيم بفعالية نوعية (2.6 U/mg). 

3- ووجد ان طور الثبات الاوسط (Middle Stationary Phase) هو الافضل لانتاج الانزيم حيث وصلت ذروة الانتاج خلال الساعة 22 , تم تنقية الانزيم باسلوب الترسب بكبريتات الامونيوم حيث وجد ان افضل نسبة تشبع كانت 20-40% بفعالية نوعية 2.4 U/mg ثم تم استخدام كروماتوكرافيا التبادل الايوني (DEAE-Sephacel) حيث تم تمييز نوعين من الانزيم الاول GTF-I بفعالية نوعية 4.1 U/mg والثاني GTF-II بفعالية نوعية 7.2 U/mg وبنسبة انتاج (Yield) 30.1%. ثم نقي كل انزيم على حده باستخدام كروماتوكرافيا الترشيح الهلامي ووجد ان الفعالية النوعية كانت 8.3 U/mg و 35.5 U/ mg على التوالي وبنسبة انتاج 17.2%  . 

4- استخدمت العزلة المنتخبة (H5) لاستخلاص نوع آخر من الانزيم يدعى بالانزيم المرافق للخلية (Cell-associated GTF) وتم تنقيته باستخدام اليوريا ثم الترسيب بكبريتات الامونيوم فالمبادل الايوني DEAE-Sephacel ثم استخدام الترشيح الهلامي بوساطة Sepharose-6B واعطت افضل فعالية نوعية بواقع 111.6 U/mg وبنسبة انتاج 14.4%. 

5- اختبر كل من GTF و CA-GTF على تحفيز الجهاز المناعي لطيور الدجاج لانتاج الاضداد IgY في صفار البيض إذ تم حقنها داخل العضلة (Intramuscular) في منطقة الصدر وتم جمع البيض قبل وبعدالحقن لمدة 9 اسابيع وبواقع جرعتين تفصل بينهما اسبوعين , 

6- تم تنقية IgY  باستخدام الترسيب ببولي اثيلين كلايكول وكان محتوى البروتين للكل من GTF IgY- و IgY-CA-GTF (7.06 و 6.97  ملغرام / مليليتر) على التوالي .

7- تم حساب محتوى البروتين في المصل للـ GTF IgY- و IgY-CA-GTF  وكان بمقدار (2.6 و3.1 ) على التوالي . تم تقييم IgY للنماذج المحضرة باستخدام تقنية ELISA واعطى نموذج IgY-GTF اعلى معايرة بتركيز 3.5ملغرام/مل يليه نموذجا IgY-CA-GTF بتركيز 3.28 ملغرام/مل على التوالي. 

8- كان نموذج IgY-GTF الاكثر تثبيطا للفعالية النوعية لـGTF بمقدار 75% من نموذج IgY-CA-GTF  حيث كان التثبيط بمقدار 50% للفعالية النوعية لانزيم CA-GTF . 

9- سجلت الاستجابة المناعية بين المضاد الانزيمي (anti-GTF ) والمستضدات المحضرة (GTF) النقية وكذلك بين المضاد الانزيمي (anti-CA-GTF) والمستضدالمحضر(CA-GTF) باستخدام تفاعل الانتشار المناعي المزدوج على سطح هلام الاكاروزوكانت استجابة نموذج anti-GTF اقوى.